基于微载体培养的MSC细胞【下游分离技术】机遇与挑战

间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，并且易于体外收集、分离和生长，在再生医学应用中具有广阔的应用前景。

由于MSC是一种贴壁细胞，因此需要将微载体添加到培养体系中以增加细胞附着和生长的表面积。尽管基于微载体的MSC培养技术已经较为成熟，但其下游包括收获、过滤和浓缩体积在内的处理过程仍存在许多问题。

前不久，来自加拿大卡尔加里大学的Michael Kallos教授团队在Biotechnology & Bioengineering杂志上发表综述，评估了目前下游分离技术的现状，并提出了决策流程图。

细胞收获是第一个下游处理阶段，即将细胞与微载体分离。

微载体可以大致分为常规微载体和响应性微载体：

▷ 对于常规微载体培养的细胞，在收获时通常需要添加蛋白酶降解细胞间基质，从而释放细胞。在此过程中，蛋白酶可能会对细胞造成损伤而影响细胞的活力与增殖能力。

▷ 对于响应性微载体的分离，则需要添加特异性的刺激来改变微载体自身，从而导致其与细胞分离。然而一些刺激物依然无法避免对细胞的损伤，且较长的处理时间也会影响收获细胞的活力。

在本篇综述中，作者罗列了不同种类的微载体与各种蛋白酶和刺激物的作用效果，及其对于细胞活性的影响（图1、图2）。

图1：不同蛋白酶和微载体组合的比较

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图2：不同蛋白酶和微载体组合的比较

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为了避免微载体进入人体引起不良反应，在临床应用中需要使用不含微载体的高纯度MSC产品。因此，在收获阶段后，必须通过有效的纯化过程将细胞悬浮液与微载体分离。通常采用的过滤手段是尺寸排阻技术，因为微载体（直径在150到250 µm之间）的尺寸大于MSC（直径在15到20 μm之间）。

然而，目前对于MSC的过滤技术还不是十分成熟。一般可以根据过滤微载体的效果、细胞回收率、细胞活性、大规模过滤的能力和过滤设备的商业可行性这五个指标，评估不同过滤方法的优劣（图3）。

图3：不同过滤技术的比较

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下游分离过程的最后阶段是细胞清洗与体积浓缩，这些步骤通常并行完成：

▷ 细胞清洗可以去除不需要的成分，如培养物和培养基残留物、脱离过程中的酶以及细胞悬浮液中的微载体碎片。

▷ 体积浓缩则是为了满足临床细胞治疗的需求，因为细胞治疗需要在低剂量下输送高细胞数。例如，Cunha等人（Peixoto, et al., 2015）曾估算细胞治疗所需的密度为每公斤患者体重1-8×10⁶ cells/mL，总体积为40至50 ml。

通常，最经典的方式是切向流动过滤（TFF），在此基础上，还有使用平板膜包、聚砜和聚醚砜的技术。除此之外，还有使用碟式离心机和流化床的连续离心技术。

与评估过滤技术的指标相似，清洗与浓缩步骤也同样有六个指标（细胞回收率，细胞活力，浓缩系数，商品化，处理时间，大规模处理能力）来评判各技术的优劣（图4）。

图4：不同浓缩技术的比较

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最后，作者将开发下游工艺时应考虑的几个因素做成决策树（图5），根据不同的条件选择最恰当的分离技术。利用这些信息进行研究，可以进一步优化MSC的下游处理过程，使得MSCs作为一种潜在的治疗手段离现实更近一步。

图5：MSC下游分离过程的决策流程图

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标红部分为基于3D TableTrix^®微载体及3D FloTrix^®工艺体系的细胞生产技术

参考文献：

Mawji, Inaara et al. “Challenges and opportunities in downstream separation processes for mesenchymal stromal cells cultured in microcarrier-based stirred suspension bioreactors.” Biotechnology and bioengineering vol. 119,11 (2022): 3062-3078. doi:10.1002/bit.28210

图片来源：

文中所附研究说明相关图表，均来自文献原文。

原文链接：

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/35962467/

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华龛生物核心产品3D TableTrix^® 微载体由数万颗弹性三维多孔微载体组成，孔隙率＞90%，粒径大小可控于50-500 μm，形成真正的3D仿生培养。不仅可用于贴壁细胞的育种与收获传代，还可用于病毒生产。与传统微载体相比，在细胞扩增、产毒方面优势明显。是首款可用于细胞药物开发的药用辅料级微载体。已通过中检院等相关权威机构的检测报告，并获得2项国家药监局药用辅料资质（CDE审批登记号：F20210000003、F20200000496）,获得美国FDA DMF药用辅料资质（DMF：35481）。

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3D FloTrix^® Digest裂解液

此外，华龛生物专为细胞治疗产品生产而设计了高通量自动化细胞处理设备3D FloTrix^® vivaPREP PLUS细胞收获系统，配合封闭式无菌一次性管路包，可以实现多种细胞的大规模封闭式洗涤、收获、分装制剂等生产制备流程（图6）。

3D FloTrix^® vivaPREP PLUS细胞收获系统

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图6：细胞生产制备应用场景

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依靠其核心连续流离心清洗技术，在对细胞形成充分保护的情况下，收获流速最高可达18L/h。对于MSC细胞的回收率高达95 %，细胞活率均达到95 %以上。将收获的MSC细胞培养5天，可达到10倍以上扩增，增殖能力好，真正实现高效率、低损伤、高性能地收获百亿量级贴壁细胞。